COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA

PARECER TÉCNICO Nº 1435/2023/SEI-CTNBio - Membros

PARECER TÉCNICO N^o 8727/2023

Processo SEI nº: 01245.005291/2023-17

Requerente: Universidade Feevale.

CNPJ: 91.693.531/0001-62

Endereço: ERS-239, 2755, Novo Hamburgo, RS - CEP 93525-075.

Assunto: Solicitação de parecer para emissão de Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB) e para realização de atividade em contenção  com Organismo Geneticamente Modificado (OGM) com Nível de Biossegurança 2 (NB-2).

Extrato Prévio: 8795/2022, publicado no Diário Oficial da União em 29/03/2023.

Reunião: 265ª Reunião Ordinária da CTNBio, realizada em 05 de outubro de 2023.

Decisão: DEFERIDO

N^o de CQB concedido: 624/23

1. FUNDAMENTAÇÃO TÉCNICA (de acordo com informações do demandante)

O Responsável Legal pela Universidade Feevale, Sr. Cleber Cristiano Prodanov, solicita parecer para emissão de CQB com NB-2, para execução da atividade de pesquisa em regime de contenção com OGMs.

A declaração formal dos interessados quanto à competência técnica e de infraestrutura da Unidade Operativa para a execução do trabalho programado encontra-se no processo (documento SEI 10880928).

O Organograma da instituição encontra-se no processo (documento SEI 10880913).

Constituição da Pessoa Jurídica interessada:

Universidade Feevale.

CNPJ: 91.693.531/0001-62.

Endereço: ERS-239, 2755, Novo Hamburgo, RS - CEP 93525-075.

Unidade Operativa:

Laboratório de Microbiologia Molecular (158,16 m²) e o Laboratório de Citotoxicidade (30,36 m²).

Finalidade da solicitação de concessão de CQB:

Pesquisa em regime de contenção.

Atividades desenvolvidas com:

Vírus.

OGM:

a. Organismo receptor: Parapoxvírus ovino (ORFV);

b. Organismo parental: Vírus da hepatite E (HEV);

c. Construção genética utilizada: Vetor recombinante; 

d. Vetor: Escherichia coli TOP10.

Relação dos OGMs e derivados que serão objeto das atividades

Parapoxvírus ovino (nome científico, Orf virus, ORFV) carreando o gene da ORF2 do vírus da hepatite E (nome científico Orthohepevirus, HEV).

Uma amostra de HEV, genótipo 3, cultivada in vivo em Cynomolgus se encontra em estoque no ultrafreezer na sala 104D (NB1) do Laboratório de Microbiologia Molecular.

Sequência nucleotídica: A partir das sequências nucleotídicas do gene ORF2, do vírus da Hepatite, genótipo 3, disponíveis na base de dados “Gene Bank” (National Center for Biotechnology Information – NCBI), se procederá um estudo bioinformático utilizando os softwares Bepipred e MHC-Pred para determinar as regiões imunodominantes e imunogênicas da sequência peptídica codificada por este gene. O fragmento previsivelmente mais imunogênico será clonado e sintetizado para comparação já contendo extremidades de ligação ao vetor de parapoxvírus no Laboratório de Amplificação 103A1 (NB1) do Laboratório de Microbiologia Molecular.

Construção do vetor de recombinação - Inicialmente será realizada uma PCR convencional, utilizando uma enzima de alta fidelidade, a sequência nucleotídica do gene ORF2 do HEV, genótipo 3, que codifica uma região conservada e imunogênica da proteína do capsídeo do vírus. A clonagem se efetuará no vetor pTE-20, o qual contém uma região formada por 8 moléculas de histidina, necessárias para facilitar a purificação das proteínas recombinantes produzidas (Laboratório de Amplificação 103A1 – NB1). Posteriormente, se transformará a construção (vetor + proteína de interesse) em células competentes de Escherichia coli TOP10. As células transformadas serão semeadas em agar Luria Bertani (LB) com ampicilina (100µg/ml) e incubadas durante toda uma noite a 37°C (Laboratório de Virologia 103A3 – NB2). A partir das colônias resultantes, se comprovará mediante uma PCR a presença da construção (pET-20-His-orf2) e a inexistência de mutações mediante sequenciamento de nova geração da sequência de nucleotídeos assim clonada utilizando o sequenciador Miseq (Illumina) (Laboratório de Amplificação 103A1 – NB1).

Inserção do gene de interesse no genoma de parapoxvírus ovino (ORFV) - Os vírus recombinantes contendo o gene da ORF2 do HEV serão gerados por recombinação homóloga entre os vírus com deleção em ORFV113 (OV-IA82∆113), ORFV118 (OV-IA82∆118), ORFV119 (OV-IA82∆119) e ORFV121 (OV-IA82∆121) e os plasmídeos de recombinação gerados anteriormente. Células de cultivo primário OFTu serão infectadas com cada vírus parental (multiplicidade de infecção [m.o.i.] = 1) e subsequentemente transfectadas com 2 μg de cada plasmídeo de recombinação utilizando-se Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) de acordo com as recomendações do fabricante. Após 72 h, a infecção/transfecção os cultivos celulares serão coletados, submetidos a três ciclos de congelamento-descongelamento, centrifugados a 400 x g por 10 min e o sobrenadante armazenado a -80°C. Os vírus recombinantes serão selecionados e purificados por diluição limitante seguida de imunoperoxidase em cultivo celular e de PCR específica para o gene ORF2-HEV. Células OFTu serão cultivadas em placas de 96 poços e infectadas com diluições seriadas (10-1 a 10-6) do lisado de células coletados a partir da infecção/transfecção. Após 96 h, o sobrenadante será transferido para placas de 96 poços novas e armazenado a -80°C. As células serão fixadas com solução de 3,7% formaldeído em solução tampão de salina (Phosphate Bufferd Saline – PBS) por 20 min, lavadas três vezes com PBS e em seguida tratadas com solução de 0,1% de H2O2 a fim de inativar a peroxidase endógena. Para prevenir reatividade inespecífica do anticorpo primário, as células serão incubadas por 30 min a temperatura ambiente com solução de 10% de soro caprino em PBS e em seguida incubadas por 1 h a temperatura ambiente com o anticorpo primário anti-Flag (10 μg/ml; anti-FLAG M2, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O excesso de anticorpo primário será removido por três lavagens com PBS. Em seguida, as células serão incubadas por 30 min a temperatura ambiente com o anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com HRP (anti-camundongo IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). As células serão lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween 20, incubadas por 15 min a temperatura ambiente com o substrato DAB (DAB Plus Substrate Staining System; Thermo Scientific, Whaltman, MA), e analisadas com um microscópio invertido. Poços nos quais placas de replicação viral corados pelo DAB forem identificados serão submetidos a novas diluições limitantes (Laboratório de Virologia 103A3 – NB2). A inserção do gene ORF2-HEV por PCR e as regiões genômicas envolvidas no processo de recombinação serão avaliadas por sequenciamento genético. Os recombinantes terão seu genoma completamente sequenciado por sequenciamento de nova geração, para caracterização da inserção do gene de interesse e de possíveis alterações em relação aos genomas parentais (Laboratório de Amplificação 103A1 e 103A2 – NB1).

Caracterização dos recombinantes in vitro - A cinética de replicação dos ORFV recombinantes contendo o gene ORF2-HEV será analisada in vitro e comparada com àquelas dos vírus parentais. Células primárias OFTu e células de linhagem originárias de suínos (SK6, PK15, entre outras) serão inoculadas com os vírus recombinantes ou com os vírus parentais e a cinética de replicação será avaliada por curvas de replicação (multi step; m.o.i. = 0.1 ou single step; m.o.i. = 10). Os cultivos celulares inoculados com os vírus recombinantes ou parentais serão coletados em vários intervalos pós-inoculação (0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 h) e os títulos virais em cada intervalo serão determinados pelo método de diluição limitante, calculados de acordo com o método de Spearman-Karber e expressos como dose infectante para 50% dos cultivos celulares (DICC50)/mL (Laboratório de Virologia 103A3 - NB2 do Laboratório de Microbiologia Molecular).

Transporte e armazenamento – Os ORFV recombinantes serão transportados até a sala ao lado para serem armazenados no ultrafreezer em tubos hermeticamente fechados dentro de caixas com a identificação apropriada (Armazenamento de Amostras 104D – NB1).

Classe de Risco dos OGMs objetos das atividades a serem desenvolvidas

Classe de risco 2 (CR-2).

Resumo dos projetos de pesquisa e demais atividades que serão desenvolvidas com OGMs e seus derivados

O vírus da hepatite E (HEV) é um importante patógeno cuja circulação no Rio Grande do Sul é desconhecida. O HEV é um membro da família Hepeviridae e são reconhecidos hoje pelo menos quatro genótipos do vírus, além de novas estirpes hoje em fase de classificação. Os genótipos 1 e 2 de HEV são restritos aos seres humanos e associados a epidemias nos países em desenvolvimento. Os genótipos 3 e 4 HEV são considerados zoonóticos podendo circular entre suínos e humanos (ou mesmo outras espécies) e são responsáveis por casos esporádicos de hepatite em todo o mundo.

Na América do Sul circula de forma constante o genótipo 3, o qual já foi encontrado no Brasil tanto em casos humanos quanto em amostras oriundas de efluentes de suinocultura ou mesmo de abatedouros de suínos. Casos de hepatite E foram associados ao consumo de carnes de animais cruas ou malcozidas, tais como derivados de fígado, salsichas e outros embutidos. Além disso, uma vez que grandes quantidades de vírus são excretadas nas fezes, a aplicação nos solos de dejetos animais e o consequente ao lençol freático e águas superficiais colocam um risco de contaminação da água, o que constitui outra via reconhecida de infecção em seres humanos. Não havendo metodologias simples de eliminação do vírus em alimentos ou no ambiente, pretende-se no presente trabalho desenvolver um vírus com potencial vacinal para o controle de infecções pelo HEV em suínos. Será construída uma amostra recombinante de parapoxvírus ovino (ORFV) carreando o gene da ORF2 de HEV, que poderá ser utilizada posteriormente em testes em suínos.

Descrição das instalações que serão utilizadas nas atividades com OGM e seus derivados

O Laboratório de Microbiologia Molecular e o Laboratório de Citotoxicidade estão localizados no pavimento 1, salas 103 e 104, respectivamente, do Prédio Vermelho do Campus II da Universidade Feevale. Endereço: ERS-239, 2755, Novo Hamburgo, RS – 93525-075.

Dimensões:

Laboratório de Microbiologia Molecular: 158,16 m² (Planta baixa - documento SEI 10880913)

Laboratório de Citotoxicidade: 30,36 m² (Planta baixa - documento SEI 10880925).

Características de biossegurança:

O laboratório possui antessalas para paramentação, laboratórios separados para virologia, sala limpa e amplificação com fluxo unidirecional. Os laboratórios ainda contam com janela pass through para passagem de amostras e placas.

As atividades que envolvem OGM são realizadas nas seguintes condições:

a) toda equipe técnica e de apoio tem treinamento para os procedimentos realizados no Laboratório de Microbiologia Molecular e Laboratório de Citotoxicidade;

b) os espaços dos laboratórios e antessalas são amplos, com piso emborrachado e paredes lisas para facilitar a limpeza e descontaminação;

c) as superfícies das bancadas dos laboratórios são revestidas em material impermeável;

d) os espaços entre as bancadas, cabines e equipamentos permitem a limpeza adequada;

e) os laboratórios 103A1, 103A2 e 103A3 possuem sinalização universal de risco biológico, identificação do OGM, nome do técnico principal e da responsável técnico pelo laboratório, além do contato da CIBio;

f) a entrada dos Laboratórios de Microbiologia Molecular e de Citotoxicidade é restrita;

g) os usuários do laboratório 103A3 (NB2) utilizam jaleco, luvas, e máscara de proteção PFF2 e retiram estes EPIs na antessala 02, onde as luvas e a máscara de proteção é descartada em lixo biológico e o jaleco é descontaminado e guardado;

h) todos os requisitos necessários para a entrada nas instalações NB2 estão indicadas na porta do laboratório 103A3;

i) as superfícies de trabalho são descontaminadas antes e após o uso, e também em caso de contaminação acidental durante o trabalho;

j) os materiais contaminados são retirados do laboratório 103A3 em embalagens fechadas, e levados até a sala de lavagem 104B. A sala de lavagem 104B está localizada ao lado do laboratório 103A3 (NB2) e possui 1 autoclave para descontaminação de materiais e amostras. A passagem entre os ambientes é através da antessala 02, de acesso restrito;

k) os materiais descartáveis utilizados para manuseio do OGM serão descartados como resíduo biológico após descontaminação por autoclavagem. Materiais que podem ser reutilizados serão descontaminados após o uso com protocolo padrão do laboratório (hipoclorito 10% → extran → água de osmose → autoclavagem). A Universidade Feevale conta com o Grupo Interno de Gerenciamento Ambiental (GIGA) que recolhe e envia para empresa terceirizada especializada o resíduo biológico gerado;

l) os laboratórios contam com pipetadores e micropipetadores automáticos para maior segurança e confiabilidade;

m) o Laboratório de Microbiologia Molecular possui uma área administrativa e uma sala separada para refeições;

n) não é permitida a entrada de animais nos laboratórios;

o) a equipe técnica e de apoio possui treinamento interno de biossegurança;

p) materiais contaminados só são retirados do laboratório em recipientes rígidos e à prova de vazamentos;

q) os laboratórios são desinsetizados a cada 6 meses;

r) todos os usuários do laboratório recebem treinamento de biossegurança antes do início de suas atividades no laboratório. O laboratório conta com um Manual de Biossegurança acessível a todos os usuários;

s) serão mantidos registros de todos os projetos desenvolvidos com OGM e seus derivados;

t) o OGM será manipulado em cabines de segurança biológica classe II, conforme definido na NSF 49;

u) o professor Fernando Rosado Spilki, técnico principal, é responsável por autorizar a entrada de pessoal nas instalações NB2;

v) atividades e projetos com organismos não geneticamente modificados que ocorram concomitantemente e nas mesmas instalações com manipulação de OGM irão respeitar a classificação de risco do OGM; e

w) qualquer transporte de OGM e seus derivados entre unidades ou instituições com CQB serão feitas de acordo com os requerimentos especificados nas Instruçções Normativas da CTNBio.

Principais equipamentos utilizados nos experimentos, as medidas e os Equipamentos de Proteção Individual e Coletiva (EPIs e EPCs)

Sala 104D: 3 ultrafreezers, 3 refrigeradores para armazenamento de amostras, 1 refrigerador para armazenamento de reagentes e 1 congelador para armazenamento de amostras. Neste espaço os seguintes EPIs são utilizados: máscara de proteção PFF2, jaleco, óculos de proteção, luvas nitrílicas e luvas térmicas para baixa temperatura para manipulação no ultrafreezer.

Laboratório de preparação 103A2: 1 cabine de fluxo laminar, 1 mini centrífuga, 1 conjunto de micropipetadores. Neste espaço os seguintes EPIs são utilizados: máscara de proteção PFF2, jaleco e luvas nitrílicas.

Laboratório de amplificação 103A1: 1 workstation para preparo de placas de PCR, 2 termocicladores, 1 termociclador em tempo real para placas de 96 poços com três canais, 1 termociclador em tempo real para placas de 384 poços com cinco canais, um termociclador em tempo real para 36 microtubos com 6 canais, 1 sistema de sequenciamento de DNA/RNA de nova geração, 1 sistema de eletroforese, 2 conjuntos de micropipetadores, 1 refrigerador. Neste espaço os seguintes EPIs são utilizados: máscara de proteção PFF2, jaleco e luvas nitrílicas.

Laboratório de virologia 103A3: Este espaço conta com 3 cabines de segurança biológica nível 2 (EPC), 2 incubadoras com CO₂, 2 sistemas de extração de ácidos nucleicos automáticos, 1 banho-maria, 1 pipetador automático, cinco conjuntos de micropipetadores, 1 refrigerador para amostras, 1 refrigerador para reagentes, 1 centrífuga, 1 capela de exaustão (EPC), 1 microscópio invertido, 1 agitador mecânico. Para manipulação do OGM serão utilizados os seguintes EPIs: máscara de proteção PFF2/N95, macacão de proteção, óculos de proteção e luvas nitrílicas. O OGM será manipulado em cabine de segurança biológica nível 2 (EPC).

Sistema de prevenção e combate a incêndio: Alarme e sirene de incêndio (Antesala 1), extintor de água e CO2 (Antesala 1), dois detectores de fumaça (103A1 e 103A3). Uma vez disparado o alarme de incêndio, um agente de segurança patrimonial da Universidade Feevale treinado para combate a incêndio é acionado para verificar a ocorrência e tomar as medidas cabíveis.

Equipe técnica envolvida no trabalho com OGMs e seus derivados

Fernando Rosado Spilki –  Médico Veterinário, Doutor em Genética e Biologia Molecular, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2 e NB3. http://lattes.cnpq.br/3481593940960227

Juliane Deise Fleck –  Farmacêutica, doutora em Ciências Farmacêuticas, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2 e NB3. http://lattes.cnpq.br/8097010525678310

Alana Witt Hansen –  Biomédica, doutora em Ciências Biológicas, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/6611850669477314

Thaís Luise Dillenburg Weiss –  Biomédica, mestre em Toxicologia e Análises Toxicológicas, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/3926834898786605

Gabriela Saldanha Monteiro –  Bióloga, mestre em Qualidade Ambiental, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/1107697647585619

Pietra Fink –  Técnica, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/9010529397180091

Juliana Schons Gularte –  Bióloga, doutora em Qualidade Ambiental, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2 e NB3. http://lattes.cnpq.br/9703922128341380

Mariana Soares da Silva –  Médica veterinária, doutorado em Ciências Veterinárias, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/6928626438547383

Viviane Girardi –  Bióloga, doutora em Qualidade Ambiental, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/4921512361017174

Meriane Demoliner –  Biomédica, mestre em Qualidade Ambiental, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/0070293010954367

Fágner Henrique Heldt –  Biólogo, mestre em Qualidade Ambiental, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/8422872727981047

Micheli Filippi – Biomédica, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/0888623191257987

Vyctoria Malayhka de Abreu Góes Pereira – Biomédica, possui capacitação em biossegurança para trabalho em NB2. http://lattes.cnpq.br/3865542435614693

Pela análise dos currículos da equipe de pesquisa, conclui-se que esta é apta a gerir com segurança as atividades propostas.

Comissão Interna de Biossegurança - CIBio

Membros especialistas:

Annette Droste Presidente Representante da área Vegetal http://lattes.cnpq.br/5124461451961397

Caroline Rigotto Representante da área Humana http://lattes.cnpq.br/9145207802821085

Luciano Basso da Silva Representante da área de Meio Ambiente http://lattes.cnpq.br/4485363387273456

Matheus Nunes Weber Representante da área Animal http://lattes.cnpq.br/7969719508082632

Membros leigos:

Daiane Cristina da Silva Representante da Segurança e Medicina do Trabalho (SESMT) Não possui

Manuela Bruxel Representante da Diretoria de Inovação http://lattes.cnpq.br/2105067707361313

Rodrigo Staggemeier Representante da Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-graduação e Extensão (PROPPEX) http://lattes.cnpq.br/6898002232464109

Victor Lazaro Frietzen Junior Representante do Departamento Jurídico Não possui

O documento formal de nomeação da CIBio encontra-se no documento SEI 10880928.

Pela análise dos currículos da Comissão Interna de Biossegurança - CIBio, conclui-se que esta é apta a gerir com segurança as atividades propostas.

2. RELATO DA VISITA TÉCNICA:

A visita técnica foi realizada às instalações em setembro de 2023. As áreas a serem creditadas possuem acesso restrito, características compatíveis com o nível de segurança 2, protocolos de conduta de manipulação de OGMs bem definidos, protocolos de descarte de material adequados, profissionais bem treinados e com conhecimento sobre práticas envolvendo manipulação de microorganismos.

3. PARECER:

No âmbito das competências do art. 14, inciso XI, da Lei 11.105/05, considera-se que as medidas de biossegurança propostas para o presente pedido de concessão de Certificado de Qualidade em Biossegurança - CQB para que a instituição "Universidade Feevale" execute as atividades relacionadas às finalidades a que se propõe e realização de atividade em contenção, atendem à Resolução Normativa CTNBio N^o 37/2022 e demais relacionadas. Assim, observadas as condições descritas no processo e neste parecer técnico, essa atividade não é potencialmente causadora de significativa degradação do meio ambiente ou saúde humana/animal.

O parecer é pelo DEFERIMENTO da solicitação.

(Assinado eletronicamente)

Dr. Leandro Vieira Astarita

Presidente da CTNBio

Documento assinado eletronicamente por Leandro Vieira Astarita, Presidente da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, em 11/10/2023, às 09:54 (horário oficial de Brasília), com fundamento no § 3º do art. 4º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.

A autenticidade deste documento pode ser conferida no site https://sei.mcti.gov.br/verifica.html, informando o código verificador 11436754 e o código CRC 3A2C74C6.